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      流式細胞術介紹和實驗方法

      流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段,它可以高速分析上萬個細胞,并能同時從一個細胞中測得多個參數,與傳統的熒光鏡檢查相比,具有速度快、精度高、準確性好等優點,成為當代最先進的細胞定量分析技術。

      工作原理:
      將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室,不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度,這樣,鞘液就能夠包繞著樣品高速流動,組成一個圓形的流束,待測細胞在鞘液的包被下單行排列,依次通過檢測區域。流式細胞儀通常以激光作為發光源。經過聚焦整形后的光束,垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細胞在激光束的照射下,產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測,這種信號基本上反映了細胞體積的大??;熒光信號的接受方向與激光束垂直,經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度,經光電倍增管接收后可轉換為電信號,再通過模/數轉換器,將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理,將分析結果顯示在計算機屏幕上,也可以打印出來,還可以數據文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。檢測數據的顯示視測量參數的不同由多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達,其X軸為測量強度,Y軸為細胞數目。一般來說,流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數,這視其模數轉換器的分辨率而定。對于雙參數或多參數數據,既可以單獨顯示每個參數的直方圖,也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體,充電后振動,使噴出的液流斷裂為均勻的液滴,待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷,當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時,在高壓電場的作用下偏轉,落入各自的收集容器中,不予充電的液滴落入中間的廢液容器,從而實現細胞的分離。

      PI 染色操作步驟
      1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500rpm , 5min,棄上清液。
      2、加入PBS 1ml離心洗滌1次,棄上清。
      3、加入2ml預冷的70%酒精,4℃固定30min,或是-20℃固定過夜。
      4、離心,棄上清液。
      5、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心。
      6、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,37℃孵育30min,離心。
      7、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心。 
      8、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,室溫避光孵育30min。
      9、混勻,過300目篩網,置流式管中, 4℃冰箱保存,待測。

       

      GFP PI染色操作步驟

       

      1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500rpm , 5min,棄上清液。

      2、加入PBS 1ml離心洗滌1次,棄上清。

      3、加入2ml預冷PFA,PFA的濃度根據細胞的特點進行調節,4℃固定30min。

      以下步驟同PI 染色操作步驟的(4-9)

       

      細胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

       

      1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500rpm,5min,棄上清液。

      2、以冷PBA 1ml,離心洗滌,棄上清液。

      3、加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200ul。用微量移液器輕輕吹打混勻,4℃或置冰上孵育30min-1h。

      4、離心棄上清液。

      5、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,以除去未結合的多余抗體成分。

      6、向細胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,置流式管中,4℃避光保存,待測。

       

      細胞表面間接免疫熒光染色操作步驟

       

      1-2、同細胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

      3、 用PBA稀釋的第一抗體200ul,對照管加入對應于一抗的正常實驗動物IgG,輕輕吹打混勻,4℃或置冰上孵育1.5-2h。離心,棄上清。

      4、 BS1ml離心洗滌1次,以去除多余的未結合的特異性抗體。

      5、 PBA適當稀釋的熒光素標記的第二抗體200ul。吹打混勻,4℃或置冰上孵育30min,避光。

      6、 PBS 1ml離心洗滌2次。

      7、將細胞重新懸浮于500ulPBS中,混勻,置流式管中,避光,4℃冰箱保存,待測。

       

      胞內直接免疫熒光染色操作步驟

       

      1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,1500rpm , 5min,棄上清液。

      2、用1×PBS1ml洗滌1次,離心。

      3、4%PFA 1ml,4℃固定30min。

      4、用1×PBS1ml洗滌1次,離心。

      5、0、1% Triton-100 1ml, 室溫10min。

      6、用1×PBS1ml洗滌1次,離心。

      7、加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200ul,用微量移液器輕輕吹打混勻,4℃或置冰上孵育30min-1h。

      8、離心棄上清液。

      9、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,以除去未結合的多余抗體成分。

      10、向細胞中加入冷PBS500ul,吹打混勻,置流式管中,4℃避光保存,待測。

       

      胞內間接免疫熒光染色操作步驟

       

      1-6、同胞內直接免疫熒光染色操作步驟

      7、加入用PBA稀釋的第一抗體200ul,對照管加入對應于一抗的正常實驗動物IgG,輕輕吹打混勻,4℃或置冰上孵育1、5-2h。離心,棄上清。

      8、冷PBS1ml離心洗滌1次,以去除多余的未結合的特異性抗體。

      9、加入PBA適當稀釋的熒光素標記的第二抗體200ul。吹打混勻,4℃或置冰上孵育30min,避光。

      10、冷PBA1ml離心洗滌2次。

      11、將細胞重新懸浮于500ulPBS中,混勻,置流式管中,避光,4℃冰箱保存,待測。

       

       

       

      備注: 

      1、RNase A:貯液濃度:1mg/ml;

      工作液配制:加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,使終濃度為 20ug/ml。

      2、PI:貯液濃度:2、5mg/ml; 

      工作液配制:加2、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,使終濃度為 50ug/ml。

      3、PBA:即PBS加1-2% 牛血清白蛋白,加0、1%疊氮鈉。
      4、檢測樣品細胞濃度1x106 /ml。

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