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      多肽合成的常見問題

      問:多肽的兩端應如何處理?是保持自由狀態還是屏蔽起來? 
      答:多肽是用來模擬蛋白的,為了模仿蛋白的表現,我們需要合成與蛋白有相似的結構和電荷的多肽。當一條肽段從一個蛋白中“切出”之后,兩端的電荷數將與基因體蛋白有差異。我們需要改變合成策略來使他們一致。 總體而言: 如果是出自蛋白C端的序列,通過乙?;瘜端屏蔽; 如果是出自蛋白N端的序列,通過酰胺化將C端屏蔽; 如果是出自蛋白中間部分,用乙?;王0坊瘜啥硕计帘?。 

      問:如果我的肽純度是95%,那么,其余的5%都是些什么物質? 
      答:多肽的純度通常是通過HPLC,用每分鐘1%的標準乙晴梯度來檢測決定的。合成過程中,氨基酸之間的交聯效率不是總能達到100%,因而產生一系列的氨基酸缺失的雜質。大多數這樣的氨基酸缺失的雜質在純化過程中都被去掉了,但有少數的雜質其色譜表現與目標多肽很相近。這些氨基酸缺失的雜質肽留在了多肽樣品中就構成了余下的幾個百分點。

      問:如何重新溶解多肽? 
      答:多肽的溶解與多肽的序列相關,首先試蒸餾水和超聲(1-10MG/ML),如果不溶,計算肽中的堿性殘基(Lys,Arg,His和自由氨基端)和酸性殘基(Gly,Asp和自由羧基端)的數目。如果堿性基團偏多,可以滴加1N的醋酸,直到溶解為止,如果酸性基團居多,滴加1N的氨水,直到溶解為止。如果在實驗中需要用緩沖液,建議在多肽完全溶解之前不要加入鹽,因為鹽會使肽的溶解度降低。如果上述溶液中肽都不溶,可以試試用少量有機溶劑如DMSO,乙晴或DMF。

      問:什么是多肽的凈含量,它的意義是什么? 
      答:干品多肽的重量中不僅僅包含多肽,還包含有一些非肽的組份,如水,被吸收的溶劑、配位離子和鹽等。肽的凈含量是指肽在其中的重量百分比,這個百分比的數值范圍很大,可能從50%到90%,取決于純度、序列以及合成和純化的方法,不要將肽的凈含量和肽的純度混為一談,它們是完全不同的兩個概念。純度通常是由HPLC決定的。純度定義的是多肽樣品中含正確序列的組分的百分比,而肽的凈含量是指樣品中肽類物質相對于非肽類物質所占的百分比,肽的凈含量通常是用氨基酸組分分析或紫外分光法測定的。這個信息主要是在一些對肽的濃度很敏感的實驗中,對計算肽的濃度是很重要的。

      問:對不同的實驗,如何選擇肽的純度? 
      答:肽的純度是很重要的指標,純度的選擇取決于實驗的目的。對不太靈敏的篩選實驗,建議使用粗品或>75%,對免疫級別,建議選用>85%。對于受體與LIGAND相互作用的研究,生物ASSAY研究,或細胞水平的研究,建議>95%,對于結構研究,建議>98%。 

      問:如何保存多肽? 
      答:在可能的情況下,應該盡量將多肽以凍干粉的形式在-20℃下保存,這樣會在幾年內避免細菌的降解,二級結構的形成、氧化或其他修飾的發生。多肽在溶液中的穩定性要差一些,所以強烈建議使用滅菌水或滅菌過濾的方式進行溶解,如果序列中有Cys,Met或Trp等殘基,用無氧的溶劑進行溶解以避免氧化。使用冷凍的溶液時,建議將溶液進行分裝,以避免多次的溶解和冷凍對多肽造成的損害。pH的推薦范圍是3-6之間。使用前應保證包裝容器和所裝物品回溫到室溫,以避免吸水。多肽溶液最好即配即用,使用過程中將肽溶液保持在低溫但不結凍的狀態下。長期保存(3個月到5年):凍干粉,在-20℃下冷凍干燥保存;中期保存(0-3個月):-20℃冷凍液體或凍干粉冷藏;短期保存(<1周):冷藏的液體或凍干粉。 

      問:常見的是用什么方法生產多肽? 
      答:線性多肽肽鏈的延伸采用Fmoc固相合成法,由C端到N端逐步依次將氨基酸連接上。開始,將第一個氨基酸通過一段對酸敏感的連接物連接在不溶性的支撐物樹脂上。用六氫吡啶將Fmoc保護基去掉后,第二個Fmoc保護的氨基酸被連接了上去,連接方法有預活化或“一鍋煮”等。目標序列連接完畢后,用TFA將肽鏈從樹脂上洗脫得到粗品。 

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