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      技術與支持
      實驗技術指南
      Western Blotting 實驗流程

      一、概述

      1.組織取材:組織塊稱重
      2.利用液氮、研缽粉碎組織塊
      3.加入RIPA 緩沖液(每克組織3ml RIPA),PMSF(每克組織30μl,10 mg/ml PMSF),利用Polytron 進一步勻漿(15,000 轉/分*1 分鐘)維持4℃
      4.加入PMSF(每克組織30μl,10 mg/ml PMSF),冰上孵育30 分鐘
      5.移入離心管4℃,約20,000g(約15,000 轉)15 分鐘
      6.上清液為細胞裂解液可分裝-20℃保存
      7.進行Bradford 比色法測定蛋白質濃度
      8.取相同質量的細胞裂解液(體積*蛋白質濃度),并加等體積的2×電泳加樣緩沖液
      9.沸水浴中3 分鐘
      10.上樣
      11.電泳(濃縮膠20mA,分離膠35mA)
      12.電轉膜儀轉膜(100mA 40 分鐘)
      13.膜用麗春紅染色,膠用考馬斯亮藍染色
      14.Westernblot 試劑盒顯色
      15.分析比較記錄
       
      二、Western Blotting 具體實驗步驟
      1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
      可以使用適當的裂解液裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白,例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進行抽提。收集完蛋白樣品后,為確保每個蛋白樣品的上樣量一致,需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同,需要采用適當的蛋白濃度測定方法。
       
      2.電泳(Electrophoresis)
      (1)SDS-PAGE 凝膠配制
      (2)樣品處理
      在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液。例如2X 或5X 的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液。使用5X 的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。
      (3)上樣與電泳
      冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE 膠加樣孔內即可。為了便于觀察電泳效果和轉膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,最好使用預染蛋白質分子量標準。電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳,而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad 的標準電泳裝置或類似電泳裝置,低電壓可以設置在80-100V,高電壓可以設置在120V 左右。SDS-PAGE 可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。為了電泳方便起見,也可以采用整個SDS-PAGE 過程恒壓的方式,通常把電壓設置在100V,然后設定定時時間為90-120 分鐘。設置定時可以避免經常發生的電泳過頭。通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況,預計目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳。
       
      3.轉膜(Transfer)
      我們推薦在Western 實驗中選用PVDF 膜。**纖維素膜(NC 膜)或PVDF 膜(二氟化樹脂膜膜孔徑:0.45um)也可以使用,但**纖維素膜比較脆,在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產商的推薦使用步驟。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉膜時間越長,目的蛋白的分子量越小,需要的轉膜時間越短。在轉膜過程中,特別是高電流快速轉膜時,通常會有非常嚴重的發熱現象,最好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準,通常分子量最大的1-2 條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進行染色,以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液對完成轉膜的
      SDS-PAGE 膠進行染色,以觀察蛋白的殘留情況。
       
      4.封閉(Blocking)
      轉膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western 洗滌液中,漂洗1-2 分鐘,以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟,一定要注意膜的保濕,避免膜的干燥,否則極易產生較高的背景。用微型臺式真空泵吸盡洗滌液,加入Western 封閉液,在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60 分鐘。對于一些背景較高的抗體,可以在4℃ 封閉過夜。
       
      5.一抗孵育(Primary antibody incubation)
      參考一抗的說明書,按照適當比例用Western 一抗稀釋液稀釋一抗。用微型臺式真空泵吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳,可以在4℃緩慢搖動孵育過夜?;厥找豢?。加入Western 洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10 分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5-10 分鐘。共洗滌3 次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。
       
      6.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
      參考二抗的說明書,按照適當比例用Western 二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。用微型臺式真空泵吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時?;厥斩?,加入Western 洗滌液,在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10 分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5-10 分鐘。共洗滌3 次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。
       
      7.蛋白檢測(Detection of proteins)
      參考相關說明書,使用BeyoECL, Western 熒光檢測試劑等ECL 類試劑來檢測蛋白。洗片時可以使用X 光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機,可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進行手工洗片。
       
      8、膜的重復利用(Membrane recovery)
      如果蛋白樣品非常寶貴,可以使用Western 一抗二抗去除液處理蛋白膜,以重復利用蛋白膜。
       
      三、實驗注意事項
      1.把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到**纖維膜上;
      a. 轉移緩沖液洗滌凝膠和**纖維素膜,將**纖維素膜鋪在凝膠上,用5ml 移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡
      b. 在凝膠/濾膜外再包一張3mm 濾紙(預先用轉移緩沖液浸濕),將凝膠夾在中間,保持濕潤和沒有氣泡
      c. 將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中,凝膠面向陰極
      d. 將上述裝置放入緩沖液槽中,并灌滿轉移緩沖液以淹沒凝膠
      e. 按照廠家所示接通電源開始電泳轉移
      f. 轉移結束后,取出薄膜和凝膠,棄去凝膠
       
      2.將薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量標準顯現時取出,記錄下標準位置;
      3.用100ml 水洗滌纖維素膜,必要時可用脫色緩沖液;
      4.膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1 小時;
      5.室溫下,用PBS-Tween 緩沖液洗滌薄膜
      6.用封口機將薄膜封入塑料袋中,盡可能不留空氣;
      7.袋的一角剪一緩沖液的小口,用透析袋夾緊;
      8.混合:NGS(100 微升),印跡緩沖液中的抗體(2.5-5 毫升),加在裝薄膜的袋中,于室溫下搖動2 小時(或4℃過夜);
      9.用總體積300ml PBS-Tween 緩沖液,分4 次在一淺盤中洗滌薄膜,每次75ml;
      10.將連接生物素的羊抗兔IgG(40 微升溶于10 毫升印跡緩沖液/100 微升 NGS)加在袋內,于室溫下搖動1 小時;
      11.按步驟9 洗滌;
      12.加入抗生素蛋白-HRP(40 微升溶于10 毫升印跡緩沖液/100 微升 NGS),于室溫下搖動;
      13.Western Blot 中轉移在膜上的蛋白處于變性狀態,空間結構改變,因此那些識別空間表位的抗體不能用于Western Blot 檢測。這種情況可以將表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白先生物素化,再用酶標記親和素進行Western Blot。實驗中取膠和膜需帶手套。

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