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      艱難梭菌及其檢測技術研究進展

      1 艱難梭菌簡介

      艱難梭菌又叫“艱難梭狀芽孢桿菌”,最早發現于上世紀30年代,是造成醫院感染和住院病患腹瀉的常見。普通人群中約有3%的人的腸胃中都有這種細菌,在正常情況下,該細菌受制于人體內的其他細菌,不會危害人體健康。但對于長期或是大量服用抗生素的病人而言,這種細菌是可怕的,甚至是致命的。這是由于藥物破壞了人體腸胃中各種菌類之間的平衡,所以容易導致“艱難梭菌”感染。就“艱難梭菌”本身而言,其致命性并不高,在0.6%到1.5%之間,但由于感染該細菌通常會伴隨偽膜性結腸炎的出現,一旦出現這種情況,死亡率就會猛增到35%到50%。而且,與所有的細菌一樣,“艱難梭菌”會通過突變產生新的變種,而這些變種細菌的毒性和對人體的危害性、致命性通常也更強。

       

      2 艱難梭菌的傳統檢測方法

      所有艱難梭菌菌株皆表達抗原谷氨酸脫氫酶,但是艱難梭菌分為產毒菌株和不產毒菌株兩種。僅產毒菌株分泌毒素A和毒素B。毒素A和毒素B都可以導致艱難梭菌相關疾病的發生。艱難梭菌的檢測主要是通過對疑似病例的糞便中毒素的檢測完成[1]。直接糞便毒素測定包括細胞毒素測定(CTA)和酶測定(EIA)[2]。CTA中毒素B的檢測被認為是艱難梭菌檢測的金標準[3]。CTA涉及到將培養的細胞暴露到有或者沒有抗毒素存在的排泄抽提物中。如果排泄物樣本是艱難梭菌陽性,則對沒有經過抗毒處理的培養細胞有毒害作用[4]。

      艱難梭菌也可以通過在厭氧條件下培養而被檢測。這種方法具有很高的靈敏度,但是也很耗費時間,需要超過三天的時間。另外,這種方法不能區分產毒菌株和非產毒菌株。利用EIA對細菌培養分離株進行進一步測試,主要是鑒定艱難梭菌菌株是否產毒 [5]。

      傳統的C.diff測驗都是根據以下三種方法中的一種或者結合幾種進行的:細胞培養測定中的細胞毒素檢測; 艱難梭菌毒素A、腸毒素、或者毒素A和毒素B的酶免疫測定(EIA)檢測; 艱難梭菌的厭氧培養。[6]

       

      2.1 細胞培養測定中的細胞毒素檢測

      過濾的糞便抽提物加到微量滴定板上處于生長的健康的單層細胞中,培養48h。如果樣本中存在細胞毒素(一般是艱難梭菌毒素B),將會導致單層細胞聚集,脫離板(稱為細胞病變效應,CPE)。非特定細胞毒素的鑒別是通過加入向第二個孔(孔內有病人的糞便抽提物)加入特定的抗毒素(實際上是培育一種相似的C. sordellii)。只有起始的CPE是由于艱難梭菌毒素B引起的,在相應的孔中抗毒素才會阻止CPE。一般認為,細胞毒素中和(CTN)測定是實驗室檢測中最靈敏和精確的,但是存在兩個主要的缺點:出結果的速度不夠快,從而影響了及時的臨床診斷;這種方法需要專業的技術和連續的組織培養[7]。

       

      2.2 艱難梭菌毒素A、腸毒素、或毒素A和毒素B的酶免疫測定(EIA)檢測

      一些商業產品通過檢測在主要存在于有生長力的艱難梭菌細胞的一種蛋白質,叫谷氨酸脫氫酶(GDH),結合毒素檢測。因為糞便中的毒素易分解,特別是如果在轉移到實驗室的過程中經過耽誤,毒素測驗很可能會錯誤地成陰性,然而GDH是相當穩定的,通??梢员砻魑⑸锏拇嬖?。這種方法的缺點包括缺乏靈敏性,一些菌株毒素的改變使得不能被商業化產品檢測出來;一些無毒素的艱難梭菌也可分泌出GDH(假陽性結果);一次進行這些檢測的費用;如果EIA測驗是成批進行以提高工作流程和成本效益,將會使周轉時間延長。

       

      2.3 艱難梭菌的厭氧培養

      培養是所有檢測中最靈敏的方法。但是必須進行二次檢測以判斷產物毒素是否存在,因為非毒性菌株還是比較常見的。這就延長了出結果的周轉時間。另外,艱難梭菌的芽孢是極其堅固的,但是有生長力的形式卻比較脆弱,必須維持厭氧環境以使其恢復生長。一種特殊的介質——環絲氨酸-頭孢西丁果糖瓊膠(CCFA),必須在厭氧環境下儲存并培養48h,以達到最佳的恢復。因為培養技術的困難和結果輸出的延遲,在相對很少的檢測性實驗室中會對艱難梭菌進行培養。早先的研究區分疾病通常包括在內鏡檢查術下宏觀觀察粘膜的外觀,通過組織病理學比較(假膜是由剝落的細胞組成的白色或者黃色粗糙的物質構成),或者在結腸粘膜的活體組織上觀察到的的微觀病變。目前這種有擴散性的檢測在今天已經幾乎不被利用了,實驗室測驗是檢測的主要模式。這使得測驗和標準的選擇至關重要。

      最近已經有文獻報道了采用兩步方法后的更好的結果:對微生物本身非常靈敏的檢測,首先利用EIA檢測GDH,緊接著對細胞毒素和中和的二次檢測。因為在所有病人的糞便標本中的艱難梭菌,對GDH的快速檢測將都是陽性的,不管毒素的性質是否已經在運輸過程中分解,這種方法是最靈敏的。糞便在其最初的檢測中被認為是陰性的,即可立刻被報告時陰性的。因為第一個樣本是最有價值的??醋o者可以進行其他的檢測方法,并使得改變抗生素療法決定的立即必要性得到阻止。實驗室必須繼續進行細胞毒素測定,這使得周轉時間增加,或者培養和毒素測驗的時間增加。然而,兩步方法是最有效的。

       

      3 艱難梭菌的快速檢測方法

      目前市場上有很多艱難梭菌快速檢測方法,其中以Meridian Premier C. difficile Toxin A+B ELISA, TechLab Tox A/B Quik Chek, TechLab Toxin A/B II, ImmunoCard Toxin A&B的檢測效果相對較好。ImmunoCard Toxin A&B test最大化地縮短了檢測時間,整個過程為16-24分鐘。另外,這種測驗是一個單項測驗EIA,可能在臨時檢測的應用上是實用可行的。其他的快速檢測方法需要自動板閱讀設備、板清洗機、或者一些消耗品(如不包括在檢測試劑盒在內的準備試劑盒等)。大多數的研究都強調,需要更加縝密的方法如CTA或者厭氧培養等,以確認快速檢測的結果。另外,快速檢測可以用來作為鑒定艱難梭菌陽性個體的初步的篩選方法,可以減少在艱難梭菌感染檢測的延誤。但是這些快速檢測普遍存在靈敏度低和陽性預測值率等缺點[5]。因此,臨床上迫切需要一種快速靈敏的艱難梭菌檢測方法。

       

      4 艱難梭菌分子生物學檢測方法

      目前的有研究表明,利用分子學方法進行艱難梭菌檢測更有效[12,13]。 Peterson 等評價了real- time PCR檢測是利用引物以毒素B基因的一段保守區域為靶點。 由于所有產毒菌株都攜帶毒素B(有些缺少毒素A),這被視為是產毒菌株的很好的替代標記。

      這個研究是分兩個階段進行。第一階段是將送到實驗室的618個艱難梭菌檢測標本,進行普通的EIA測驗與PCR測驗比較。與結合毒素測驗的厭氧培養的金標準比較,EIA的靈敏度為67%,精確度為92%,而PCR的靈敏度為94%,準確度為97%。在這個階段,調查者還設定了一套明確艱難梭菌相關性腹瀉診斷的標準,并發現幾乎所有真正的CDAD病例每天會有3次或者更多的排便。對符合該標準的采自病人的370個標本,PCR檢測的靈敏度比EIA的更高(93% vs. 73%)。real-time PCR和厭氧培養測定皆比酶免疫測定(EIA)更加靈敏(P<.01 to P<.05)。作者總結,與EIA相比,real-time PCR是一個更加靈敏,相對迅速的測驗,應該在臨床實踐中考慮替代用來檢測毒性艱難梭菌的酶免疫測定。

      目前市場上推出的艱難梭菌快速分子檢測有BD GeneOhm real-time PCR test和Cepheid公司的GeneXpert C. difficile快速檢測方法等。Stamper等(2009)評價了BD GeneOhm real-time PCR test的檢測效果,引用的標準是商業化應用的CTA(Wampole C.difficile Toxin B test)。通過研究表明,GeneOhm的靈敏度為83.6% (95% CI: 74.3% to 92.9%) ,精確度為98.2% (96.8% to 99.6%),PPV 和NPV分別為 89.5% (81.5% to 97.4%) 、97.1% (95.3% to 98.9%)。整個GeneOhm real-time PCR test大概需要3h,而一般CTA需要24-48h,厭氧培養的時間大約為5天。作者總結認為,GeneOhm是一個快速靈敏的C.difficile分子檢測方法[14]。

      而Cepheid公司推出的GeneXpert C. difficile快速分子檢測,具有更強大的優勢。整個檢測過程僅需要30分鐘。與肉湯富集產毒培養進行比較,其靈敏度為93.5%,精確度為94.0%。與現有的PCR檢測、細胞毒素測定、EIA等各種檢測方法比較,其具有高度的靈敏度。因此,相比之下,GeneXpert C. difficile檢測是一種更加快速、靈敏的檢測方法。

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